《镖行天下之走单骑》的故事发生在明朝。京城突发一桩血腥的灭门惨案，富翁周葵富（闵政 饰）一家惨遭屠戮，唯一幸存的女儿采儿（王莎莎 饰）也因此陷入危局。临死前，周葵富将一枚柳哨交给采儿，并嘱托她投奔天下镖局的王振威（周群达 饰），请王振威护送她回到山西老家，将惨案真相告知家族长老。
随着调查展开，采儿得知幕后黑手竟是继母玉观音（孟广美 饰），她策划这一切的目的，是侵吞周葵富留下的全部财产。逃亡途中，采儿偶然遇到了同样准备前往山西的王振威。她女扮男装，与王振威结伴同行，却没想到一路危机四伏，接连不断的刺客始终将目标锁定在她身上。两人历经艰险终于抵达目的地，却不料又落入了玉观音精心布下的圈套。
